2.2　转染及其体系优化

　　① 取对数生长期 Rin-m5F细胞消化成单个的细

　　胞悬液，均匀接种于 6 孔板中，设置细胞密度分别为2×10 5 、4×10 5 个·mL- 1 ，CO2 培养箱过夜培养;

　　②根据转染试剂说明书上推荐的使用浓度制备转染溶液，质粒(μg)∶转染试剂(μL)分别为 1∶2、1∶3、1∶4。取 2.5 μg pCMV6-AC-GLP1R-GFP 质 粒 溶 于 97 μL无血清 RMPI 1640 培养基中，轻轻来回混匀，室温静置5 min，使质粒与培养基充分混匀;再按照比例相应加入转染试剂，轻轻来回混匀，室温静置 40 min，使混合物充分混匀;

　　③ 弃掉 6 孔板中的培养基，用 PBS 洗2 遍，每孔加入 2 mL新鲜完全培养基;

　　④ 在转染组逐滴加入转染溶液，边加边晃动 6 孔板，使转染液与细胞培养基充分混匀。

　　⑤ 标记好空白组及对照组，将细胞放入 CO 2 细胞培养箱中，37℃、5%CO 2 培养24 h;

　　⑥倒置荧光显微镜下观察，随机选取视野并拍照。运用软件 Image-Pro-Plus 6.0 统计细胞数目，计算转染效率;

　　⑦ 去掉转染溶液，PBS 洗 2 遍，加入新鲜完全培养基恢复培养 2 d，备用。

　　2.3　优化 G418 筛选浓度

　　① 取对数生长期 Rin-m5F细胞消化成单个的细胞悬液，均匀接种于 24 孔板中，过夜培养。

　　② PBS 洗2 遍，更换新鲜培养基，按下面浓度加入 G418 溶液：1000、600、200、100、50、0 μg·mL -1 。

　　③ 按照步骤②中 G418 浓度梯度，每 2 日更换 1 次新鲜培养基(含 G418)，连续培养观察 14 d。若孔内细胞大量死亡，则该孔 G418 减半筛选;若孔内细胞已全部死亡，则该孔停止加入 G418 溶液。每日在倒置显微镜下观察细胞死亡情况。

　　④ 将“2.2”项下恢复培养 2 d 后转染组的细胞，加入 1 mg·mL -1 G418 溶液培养 2 d，PBS 洗 2 遍，更换新鲜培养基继续培养，每日观察细胞生长情况。

　　2.4　筛选单克隆细胞株

　　① 按照“2.2”项下最佳转染体系转染细胞，24 hefficient for screening GLP1R agonists, owint to its advantage of admixture-screening, high throughput, lowfalse positive rate, fewer samples needed and ease of application comparing to the traditional screening model.Key words: glucagon like peptide-1 receptor; Rin-m5F; plasmid transfection787

　　中南药学 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期　Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6后去转染液，PBS 洗 2 遍，更新 2 mL新鲜培养基，37℃、5%CO 2 恢复培养 2 d。

　　② 加入 G418，筛选转染细胞。按“2.3”项下筛选得到的 G418 浓度，先选用使细胞大量死亡的浓度，然后更换小浓度 G418 继续筛选。

　　③ 每日在倒置荧光显微镜下观察，当转染组中未被转染的细胞全部被杀死，则停止 G418 筛选。

　　④PBS 洗 2 遍，更换新鲜培养基，37℃、5%CO 2 培养，至绿色荧光细胞出现单克隆团细胞。期间根据培养基颜色及细胞状态及时更换新鲜完全培养基。

　　⑤ 采用梯度稀释法筛选单克隆细胞株：将转染组中孔内的细胞用胰酶消化，弃掉胰酶，加入 1 mL新鲜完全培养基将细胞吹打成单个的细胞悬液。按照 10 倍稀释法，将细胞加入 96 孔板中依次进行稀释，直至孔内细胞浓度为 1 ～ 2 个每 100 μL。

　　⑥ 每日置于倒置荧光显微镜下观察，根据实际情况为细胞更换新鲜完全培养基。