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​东波教授论文(GLP1R-GFP稳定转染 Rin-m5F 细胞系的构建)(3)
2019-09-20 19:56 来源:中视财经网

  2.2 转染及其体系优化

  ① 取对数生长期 Rin-m5F细胞消化成单个的细

  胞悬液,均匀接种于 6 孔板中,设置细胞密度分别为2×10 5 、4×10 5 个·mL- 1 ,CO2 培养箱过夜培养;

  ②根据转染试剂说明书上推荐的使用浓度制备转染溶液,质粒(μg)∶转染试剂(μL)分别为 1∶2、1∶3、1∶4。取 2.5 μg pCMV6-AC-GLP1R-GFP 质 粒 溶 于 97 μL无血清 RMPI 1640 培养基中,轻轻来回混匀,室温静置5 min,使质粒与培养基充分混匀;再按照比例相应加入转染试剂,轻轻来回混匀,室温静置 40 min,使混合物充分混匀;

  ③ 弃掉 6 孔板中的培养基,用 PBS 洗2 遍,每孔加入 2 mL新鲜完全培养基;

  ④ 在转染组逐滴加入转染溶液,边加边晃动 6 孔板,使转染液与细胞培养基充分混匀。

  ⑤ 标记好空白组及对照组,将细胞放入 CO 2 细胞培养箱中,37℃、5%CO 2 培养24 h;

  ⑥倒置荧光显微镜下观察,随机选取视野并拍照。运用软件 Image-Pro-Plus 6.0 统计细胞数目,计算转染效率;

  ⑦ 去掉转染溶液,PBS 洗 2 遍,加入新鲜完全培养基恢复培养 2 d,备用。

  2.3 优化 G418 筛选浓度

  ① 取对数生长期 Rin-m5F细胞消化成单个的细胞悬液,均匀接种于 24 孔板中,过夜培养。

  ② PBS 洗2 遍,更换新鲜培养基,按下面浓度加入 G418 溶液:1000、600、200、100、50、0 μg·mL -1 。

  ③ 按照步骤②中 G418 浓度梯度,每 2 日更换 1 次新鲜培养基(含 G418),连续培养观察 14 d。若孔内细胞大量死亡,则该孔 G418 减半筛选;若孔内细胞已全部死亡,则该孔停止加入 G418 溶液。每日在倒置显微镜下观察细胞死亡情况。

  ④ 将“2.2”项下恢复培养 2 d 后转染组的细胞,加入 1 mg·mL -1 G418 溶液培养 2 d,PBS 洗 2 遍,更换新鲜培养基继续培养,每日观察细胞生长情况。

  2.4 筛选单克隆细胞株

  ① 按照“2.2”项下最佳转染体系转染细胞,24 hefficient for screening GLP1R agonists, owint to its advantage of admixture-screening, high throughput, lowfalse positive rate, fewer samples needed and ease of application comparing to the traditional screening model.Key words: glucagon like peptide-1 receptor; Rin-m5F; plasmid transfection787

  中南药学 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期 Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6后去转染液,PBS 洗 2 遍,更新 2 mL新鲜培养基,37℃、5%CO 2 恢复培养 2 d。

  ② 加入 G418,筛选转染细胞。按“2.3”项下筛选得到的 G418 浓度,先选用使细胞大量死亡的浓度,然后更换小浓度 G418 继续筛选。

  ③ 每日在倒置荧光显微镜下观察,当转染组中未被转染的细胞全部被杀死,则停止 G418 筛选。

  ④PBS 洗 2 遍,更换新鲜培养基,37℃、5%CO 2 培养,至绿色荧光细胞出现单克隆团细胞。期间根据培养基颜色及细胞状态及时更换新鲜完全培养基。

  ⑤ 采用梯度稀释法筛选单克隆细胞株:将转染组中孔内的细胞用胰酶消化,弃掉胰酶,加入 1 mL新鲜完全培养基将细胞吹打成单个的细胞悬液。按照 10 倍稀释法,将细胞加入 96 孔板中依次进行稀释,直至孔内细胞浓度为 1 ~ 2 个每 100 μL。

  ⑥ 每日置于倒置荧光显微镜下观察,根据实际情况为细胞更换新鲜完全培养基。

  ⑦当 96 孔板内细胞密度达到 30%时,消化细胞移入 24孔内扩大培养。