加入各浓度 G418 培养细胞，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状态。观察得到 10 ～ 14 d 最低浓度至全部细胞死亡的 G418 浓度为 100 μg·mL -1 。但是Rin-m5F细胞在 G418 作用 48 h 后，浓度 1 mg·mL -1组的细胞基本全部死亡。Rin-m5F细胞转染组在 1788Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15No.6 中南药学 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期mg·mL -1 G418 中培养 48 h 后，未转染的细胞大量死亡，转染成功带绿色荧光的细胞形态无显著变化，继续培养，带绿色荧光的细胞开始分裂增殖(见图 2)。
图 2 荧光显微镜细胞观察图(scale bar= 100 μm)
Fig 2 Fluorescence microscope-observation ofcells(scale bar = 100μm)
3.4 筛选单克隆细胞株
Rin-m5F细胞孵育转染溶液 24 h、更换新鲜完全培养基恢复培养 24 h、1 mg·mL -1 浓度的 G418 筛选培养 2 d 后，倒置荧光显微镜下观察未被转染的细胞基本全部死亡。降低 G418 浓度至 100 μg·mL -1 ，每3 日更换 1 次新鲜完全培养基，成功转染的细胞扩大培养 12 d，按照 10 倍稀释法消化细胞接种于 96 孔板，选取荧光强、分布均匀的单克隆细胞并扩大培养，倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察、拍照，结果见图 3。
图 3 Rin-m5F/ GLP1RGFP 单 克 隆 细 胞 观 察 图(scale bar= 200μm、10 μm)
Fig 3 Observation ofRin-m5F/ GLP1R-GFP monoclonal cells(scalebar= 200 μm、10 μm)
3.5 蛋白印记鉴定
以 Rin-m5F为空白对照，53 KD 处转染后获得的单克隆细胞株 Rin-m5F/GLP1R- GFP 中 GLP1R 表达量增加，结果见图 4。结果表明：GLP1R 已成功转染，并在单克隆细胞中稳定表达。
图 4 GLP1R 的表达
Fig 4 Expression of GLP1R
3.6 模型验证
单克隆细胞株 Rin-m5F/GLP1R-GFP 在不同条件下孵育，收样、制片，置于激光共聚焦下观察并拍照，结果见图 5 ～ 6。如图所见，溶剂对照组中细胞绿色荧光均匀分布，阴性对照组(非 GLPlR 靶点药物)中无明显荧光斑点，阳性对照组(GLPlR 激动剂药物)中细胞内出现明显的荧光斑点。
图 5 不同浓度药物处理细胞 1 h 结果(scale bar= 10 μm)Fig 5 Cells treated with different concentrations of drugs for 1 h(scalebar= 10 μm)
图 6 相同浓度药物处理细胞不同时间结果(scale bar= 10 μm)
Fig 6 Confocal fluorescence microscopy of cells(scale bar= 10 μm)
